糖异生作用基本上可以看成是糖酵解的逆转。但是，在糖酵解途径中有三步反应是不可逆的，即由己糖激酶、磷酸果糖激酶，丙酮酸激酶催化的反应是不可逆的。然而这三步反应仍可以通过不同酶催化“逆转”。但反应过程并非原反应过程的逆向进行。下面以反应式来表示这种“逆转”，实线为糖酵解过程，虚线为糖异生过程。
从上面反应看出，丙酮酸绕过不可逆的丙酮酸激酶经丙酮酸羧化酶催化形成草酰乙酸，再经PEP羧激酶催化生成PEP，从而实现糖酵解最后一个不可逆酶的绕过。第二步是果糖-1，6-二磷酸酶催化果糖-1，6-二磷酸水解为果糖-6-磷酸。糖酵解的第一个不可逆反应由葡萄糖-6-磷酸酶催化G-6-P的“逆转”，这样最终实现了糖的异生。
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