如何做RT-PCR实验

实验原理及过程

实验步骤
实验原理

1 所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。 去除RNA酶（外源）的影响。 高温灭菌两次可以破坏RNA酶的复性过程.虽然RNA酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA酶失活。 因为DEPC能与RNA的N结合，从而修饰RNA，所以，必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。（UV也能修饰RNA，实验时应避免。） DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。 实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。
2 在一灭菌2mL管中加入: 5mol/L异硫氰酸胍 0.7mL 苯酚 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL 必须提前准备好变性剂。 异硫氰酸胍可以变性RNA酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以是RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有机相（酚相）中，而在碱性条件下，DNA和RNA都在水相中，无法分离，所以，Ph在本是严重很关键。 苯酚用于抽提DNA和蛋白质。
3 称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中。 剧烈震荡。 低温防止内源性RNA酶降解RNA。 剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对来说高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA没有水解RNA的机会。 小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。
4 混匀,冰浴30min。

5 4℃,12000rpm,10min。
6 上清至另一离心管中 加0.4Ml氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。 去脂类。
7 40C,12000rpm,10min。
8 弃有机相（下层） 加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室温放置5min。 去脂类和蛋白质。
9 40C,12000rpm,10min 弃有机相，加入等体积异丙醇。-200C放置1h。 去糖，脱水。因为体系高盐（2mol/L NaAc），所以可以使RNA沉淀。
10 40C,12000rpm,10min 沉淀用70%乙醇洗两次。 因为提出的量很少，可能不可见，所以离心是要有方向标记。
11 室温稍干燥。 RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。
12 沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存) DEPC水中不含RNA酶。
13 RNA电泳： 1％琼脂糖胶20 mL 8μL样品 1μL样品缓冲液 1μLSYBR 100V恒压电泳 测OD260和OD260／OD280

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。使用天为时代公司的总RNA提取系统（如目录号 DP405和DP406），所获得的RNA的纯度高，基因组DNA污染少，用于RT-PCR系统可得到满意结果。
　　用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
RT-PCR引物的选择
随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。
Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。
基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。

RT-PCR影响因素
RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。
◇建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。
◇对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。
◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。