酶切产物电泳检测无条带这是怎么回事?

2025年03月18日 10:38
有2个网友回答
网友(1):

1、我不建议酶用1ul,商品化的酶都是浓缩酶,0.1-0.2就足够。太多的酶可能会有星活性。
2、如果DNA提取质量高,没有蛋白污染,那么过夜没问题,否则也不建议超长时间酶切;
3、用多少质粒不是看体积,只要100ng就看得见,先定量质粒。做双酶切,如果2个片段都不太小,那么用200ng的质粒保证可以看见。你的质粒DNA加太多了
所以酶切体系可以改改,减少DNA和酶的量,减少时间。1小时足够完成预期的反应。
4、其它问题无法回答,因为:是否BamH1/ Hind3都是单一位点?4种样品是一个质粒还是?酶确定没问题?是不是所有双酶切都有1kb片段,大小是否符合预期?

网友(2):

建议你做如下改进:
1. 原始质粒上样2ul,电泳检测,确定质粒质量没问题;
2. 所有酶切体系均改为10ul,其中质粒2ul,酶0.1ul (双酶切时另一种酶也加0.1ul ),buffer终浓度为 1×,剩下为去离子水。酶切时间为4小时左右。
3.电泳用的凝胶最好为新鲜配制的,浓度视质粒大小而定,一般为1%;
电泳的缓冲液最好也是新鲜配制的,电泳电压适当。

1KB的条带拖尾严重,可能是凝胶不新鲜,或者是电泳时电压过高,或者是酶切时间过长。上述建议中已经给出解决方法。
至于你说的奇怪现象,可能质粒已经降解,也可能是酶切过久导致降解,也可能是枪头或者离心管等器材污染,总之保证一切是新鲜的,再做一次。