重组菌当中的外源基因是否表达可以通过几个层面进行分析

2025年04月03日 23:40

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外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测
实验目的
了解IPTG诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。
实验原理
将外源基因克隆在含有lac 启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。没有加入IPTG诱导剂的时候，lacI 产生的阻遏蛋白与lac 操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制；当加入IPTG后，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过SDS-PAGE进行初步鉴定。
不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂(如二巯基乙醇)共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性的蛋白质与SDS结合并因此而带负电荷，不同的蛋白质结合SDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在SDS-PAGE电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。
聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用(即分子筛作用)，还具有浓缩作用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。
实验内容
材料：含有重组表达载体pET-B1, 空表达载体pET28b的大肠杆菌BL21。
试剂：细菌培养用的LB液体培养基，（含50μg/ml的卡那霉素）
LB平板（含50μg/ml的卡那霉素），100mMIPTG，
10mg/ml的溶菌酶（10mM Tris-HCl，pH8.0配制），
SDS-PAGE用试剂及考马斯亮蓝R250
30％(W／V)凝胶贮存液（丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套和口罩）
丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g, 加ddH2O溶至100ml，用新华3号滤纸过滤，棕色瓶中4℃保存，每隔几个月须重新配制。
Tris-HCl，pH8.8 1．5mol／L
0.5mol／L Tris—HCl，pH 6.8。
10％SDS。
10％过硫酸铵(AP，新鲜配制)。
TEMED(四甲基乙二胺)。
Tris-甘氨酸电泳缓冲液，pH8.3，可配成5×贮存液备用，临用前稀释。
工作液 5×贮存液
Tris碱 25 mmol／L Tris碱 15.1g
甘氨酸 250mmol／L (pH 8.3) 甘氨酸 94g
SDS 0.1％ 1％SDS 50ml
加ddH2O 至1000ml
样品处理液
Deionized water 3.8 ml
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.0 ml
Glycerol 0.8 ml
10% (w/v) SDS 1.6 ml
2-mercaptoethanol 0.4 ml
1% (w/v) bromophenol blue 0.4 ml
染色液 0.4％考马斯亮蓝—R250染色液。
甲醇 400m1
冰乙酸 100ml
考马斯亮蓝R250 1g
ddH2O加至 1000m1
脱色液
甲醇 400ml
冰乙酸 100ml
ddH2O 500ml
操作步骤
1将冻存的含有组表达载体pET-B1, 空表达载体pET28b的大肠杆菌BL21画线接种在LB平板上，37度培养过夜，直至平板上长出单菌落。
2 挑取单菌落至5mlLB液体培养基中，培养至OD600=0.6左右。4度放置过夜。
3 取2ml培养菌加入到48ml培养基中，继续培养至OD600=0.4-0.6之间。
4 表达载体和重组载体都分别设置诱导组与不诱导组，诱导组加入终浓度为1mM的IPTG，不诱导组不加IPTG。25度诱导培养12h。
5 取1.5ml培养菌至离心管中，5000rpm离心1分钟，收集细菌。
6 用1ml 10mM Tris-HCl（pH8.0）悬浮细菌，5000rpm离心1分钟，收集细菌。
7 加入30ul的 10mg/ml的溶菌酶，充分悬浮，4度放置2小时以上。
8 制备4%浓缩胶，12%的分离胶的SDS-PAGE胶。
按下表制备浓缩胶
水 6.1
30%丙烯酰胺溶液 1.33
0.5mol／L Tris-HCl pH 6.8 2.5
10％SDS 0.1
10％AP 0.05
TEMED 0.01
按下表制备分离胶

外源基因的表达与检测

9 超声处理5分钟，每30秒间隔50秒，12000rpm离心10分钟，取上清作为蛋白样品。
10 渠5ul测定蛋白浓度。
11 取50ug蛋白上样，加入5ul上样缓冲液，沸水浴5分钟，瞬时离心后上样。
12 170V恒压电泳至溴酚蓝至凝胶前沿。
13 染色1小时
14 脱色至条带清晰，背景明亮为止。
结果：诱导的pET-B1菌液样品在分子量61kDa处有一明显的深厚条带，而其他三种处理没有此条带。
影响蛋白质电泳分离效果的因素
1．蛋白质样品中的盐浓度影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白时最好用去离子水，再加等量2×SDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进行Sephader G25过柱。
2．SDS的质量由于变性蛋白是与SDS结合而带负电荷，蛋白结合SDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的SDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同迁移率的电泳图谱。
3．上样孔是否平齐，若上样孔不平齐，也影响蛋白电泳的迁移率。
4．为防止相邻泳道样品的扩散，而导致电泳条带的不整齐，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液。
电泳样品的准备
1．浓度单一成分1—10μg，若浓度太稀，应沉淀后再进行电泳；对于非单一成分的样品，如基因工程大肠杆菌的表达产物，其蛋白量50～100μg可取得较好的分离效果。
2．体积样品体积尽可能小，以保证电泳条带的整齐，必要时可应用6×SDS加样缓冲液以增加蛋白质的加样量。
3．盐浓度应尽可能低，可用SephaderG25快速脱盐；钾离子(K+)要除去，因为钾离子沉淀SDS。
4．分离小分子肽时，分离胶的浓度可提高到20％～25％。
5. 对照孔加入蛋白质分子量标准样品，同样也须1000C处理 3～5min。
注意事项
1. 丙烯酰胺单体和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺有神经毒性，在称量和配制时要带一次性手套，称量时最好也戴上口罩。
2. 凝固后一般不再有毒性，但考虑到存在没有完全交连的分子，实验结束后不宜直接用手拿取，要先用清水漂洗5-10分钟。
3. 室温较低时胶液不易凝固，可以在槽中加370C温水。
4. SDS很容易漂浮在空气中而吸入体内，称量时最好在通风橱中进行，或戴上口罩。
5. 在实际操作中，很容易将电极接反，请注意，负极永远接在加样孔的一端（即上负下正）

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