如何在三维培养条件下提取细胞总rna行rt-pcr

都是一样的啊，提取细胞，目的是获得RNA，RNA再反转录，获得cDNA。再用cDNA进行qPCR。提取RNA的，现在比较好的是往圣的（OneShine）Typhon。给你发下说明书吧。

OneShine Typhon Total RNA Extraction Reagent总RNA提取试剂瓶

I产品描述

OneShine Typhon Total RNA ExtractionReagent 总RNA提取试剂是一种可以用于动物、植物、微生物、病毒总RNA抽提的试剂，具有极强的细胞或病毒颗粒裂解能力，可在短时间内裂解各种生命形式的基本单位。本品含有能够有效抑制RNase的有机试剂，最大限度地减少总RNA的降解。用本产品提取的总RNA纯度高，不含基因组DNA，可以直接用于Northern blotting、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RT-PCR、poly(A)+选择、RNA酶保护分析以及构建cDNA文库等多种分子生物学实验。

经过本产品处理后，离心管中的液体分为三层，RNA在上层水相中，而中间层固体相和下层有机相中则分别包含DNA和蛋白质。因此可以对中间层和下层进行深度处理，以求获得总DNA和总蛋白；DNA的获取用乙醇沉淀即可，而蛋白质的获取则采用异丙醇沉淀法。

本产品操作简便快捷，可以在一小时内完成所有实验。

II运输与保存方法

采用冰袋运输4℃避光保存，有效期一年。保存时应封口密闭，不宜长时间暴露于空气中，以免产品遭到氧化而失效。

III注意事项

1．本产品中含有苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂，具有毒性和腐蚀性，操作时要做好保护措施并在通风橱内进行取用，不可掉以轻心。如果不慎接触皮肤或粘膜，应立即转移至通风场地并用大量的自来水冲洗或漱洗，必要时及时就医。

2．需自备氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理水等（本公司均有售），所有吸头、离心管、PCR管、玻璃容器等要用DEPC水处理或高温烘烤后才能使用，防止RNase对总RNA的降解（本公司均有售）。

3．样品用Total RNA Extraction Reagent匀浆后，如果不加入氯仿进行下游实验，先-70℃冻存，可保存一个月以上。建议抽提总RNA后尽快进行后续实验，短暂保存应放置在-70℃中，只能冻融一次。

4．过多的样本量可能会导致裂解不充分，使产物纯度降低和污染。在吸取上清液时，不可贪多和焦急，吸取后所剩上清液的液面距中间层至少有2mm以上，以免吸取到中间层导致DNA的污染，使后续实验出现假阳性。

I参考用量

V操作流程

RNA的提取

准备试剂

氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。

操作步骤

1．匀浆处理

a、组织:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml Typhon；肝脏、脑等柔软组织用匀浆仪进行匀浆处理。然后加入1mlTyphon，反复轻柔吹打，直至溶液不抽丝，样品体积不应超过Typhon体积10%。

b、单层培养细胞:去除细胞培养基，PBS冲洗一次，直接在培养板中加入Typhon裂解细胞，每250px2面积加1ml，用移液器吸打几次，转移至1.5ml离心管，反复吹打，直至溶液不抽丝。Typhon的用量应根据培养板面积而定。Typhon加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c、细胞悬液:离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Typhon，反复吸打直至溶液不抽丝。加Typhon之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃ 12000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除，取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4．第一步每使用1ml Typhon加入0.2ml氯仿，轻柔振荡或吹吸15秒，室温放置3分钟。

5．2-8℃12000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色或淡黄色水相，中间为固相。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Typhon试剂的60%。

6．把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Typhon加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

7．2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8．用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Typhon至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

9．室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10分钟。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS（本公司均有售），用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解。-70℃保存。

RNA的提取注意事项

1．从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800μl Typhon匀浆样品，离心取上清液后，异丙醇沉淀RNA前加5-10ug RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2．匀浆后加入Typhon，加氯仿之前样品可在-60—-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5—-20℃一年以上。

3．分层和RNA沉淀时也可使用低速台式离心机，2600×g离心30-60分钟。

RNA的提取常见问题分析

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底

B．RNA沉淀未完全溶解

A260/A280<1.65：

A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。

B.样品匀浆时加的试剂量太少。

C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。

D.吸取水相时混了有机相。

E.RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：

A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C.细胞在胰酶处理时过度

D.溶液或离心管未经RNase去除处理

E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

DNA污染:

A.样品匀浆时加的试剂量太少

B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液

蛋白聚糖和多糖污染:

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1mlTyphon在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，加入以上操作步骤。

DNA的分离

准备试剂

乙醇、0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)、75%乙醇、8mM NaOH

操作步骤

1．样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTyphon加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。

2．移去上清，（如需要分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTyphon加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。

3．用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每使用1mlTyphon加入1.5-2ml75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟,弃上清。

4．室温放置晾干DNA5-15分钟，用8mMNaOH溶解DNA。从50-70mg组织或10细胞中分离的DNA溶于300-600μl8mMNaOH，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE、HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物，可>12000×g离心10分钟除去。

DNA的定量

取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。理论上，人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量约分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。

分离DNA的应用

1．用于PCR  溶于8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES调pH至8.4,取0.1-1μgDNA用作PCR模板。

2．酶切反应  用HEPES或1mMEDTA调节pH至适当值。每μgDNA使用3-5单位的酶,酶用量为3-5IV/mgDNA。

DNA分离注意事项

1．DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。

2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存数月。

3．DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM可置于4℃或-20℃长期保存。

DNA的分离常见问题分析

得率低

A.样品匀浆和裂解的不彻底

B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解

A260/A280<1.70

A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中

B.酚除去不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。

DNA降解

A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪

RNA污染

A.氯仿分层后水相未完全去除

B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗脱不彻底

蛋白质的分离

准备试剂

异丙醇、含0.3M盐酸胍的95%乙醇、无水乙醇、1%SDS

操作步骤

1．取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTyphon加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。

2．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTyphon加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。

3．真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃水浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Westernblot或-5--20℃保存备用。

蛋白质的提取注意事项

1．蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5--20℃一年以上。

2．用0.1%SDS在2-8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western blot。

蛋白质的提取常见问题分析

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底

B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解

蛋白质降解：

组织取出后没有马上处理或冷冻

电泳时条带变形：

蛋白质沉淀洗涤不充分

建议楼主查询SCI文献，对于这样子的实验，还是文献中记录的比较详细，而且比较具体，这些实验做出来的过程也很详细，楼主可以参考的