求助：小片段DNA回收为何需加异丙醇

纯化DNA去除DNA溶液当中的酶类和蛋白质，经典的方法是使用氯仿抽提，或者是1:1的苯酚氯仿，或者是苯酚。两种有机溶剂混合使用要比使用单独的一种更好，因为这种方法非常有效的使蛋白质变性，酶类失活。然而，尽管苯酚可以有效的使蛋白变性，但是不能够抑制RNase的活性，而且其也是含有polyA的RNA的有效的溶剂，因此，可以通过使用两种有机溶剂同时使用的方法解决这一问题。注意：氯仿指的是24:1的氯仿异戊醇的混合物。苯酚指的是用0.1%的羟基喹啉和0.2%的贝塔巯基乙醇平衡的苯酚。1、将DNA溶液与等体积的苯酚氯仿混合2、混匀直到成为乳液状3、离心3分钟4、将上清液转移到干净的离心管中（注意不要吸取中间层）5、再重新用苯酚氯仿处理一次，即就是重复1、2、3、46、加入等体积的氯仿，混匀，重复2、3、47、用乙醇或者异丙醇沉淀注意：如果DNA片段大于10Kb，by gentle shaking。如果小于10Kb，by vortexing。如果大于10Kb，采用下列步骤:a. 20 rpm 缓慢摇匀。b. 使用大口径枪头转移DNA溶液c. 用乙醇沉淀DNA。d. 氯仿的去除可以通过透析，透析液用冷的TNE或者饱和的水。沉淀DNA最常用的是乙醇沉淀的方法。此过程是在低温（-20摄氏度）且适当的一价离子存在的情况下沉淀DNA。该方法快速且可以回收纳克级的DNA。1、确定DNA溶液的体积2、用pH8.0的水或者TE溶液调整DNA溶液中的一价离子的浓度，或者加入一定量的一价离子（见表）。浓度终浓度Sodium acetate 醋酸钠2.5 M（pH5.2）0.25 MSodium chloride 氯化钠5.0 M0.1 MAmmonium acetate 醋酸铵10.5 M2.0 M3、混匀后加入2倍体积的冷的无水乙醇，放置-20摄氏度。4、一般放置20-30分钟。如果片段小于1 Kb或者浓度非常低，可以适当延长时间或者放置-70摄氏度。5、0摄氏度离心。一般12000 rpm 离心10分钟足够。如果片度较小或者浓度较低则要延长离心时间和转速。6、去掉上清，使用吸水纸尽量吸干管中溶液，然后使用真空干燥机干燥。7、用pH8.0的水或者TE溶液溶解DNA沉淀。说明：A. 1倍体积的异丙醇通常用来代替2倍体积的无水乙醇。异丙醇的使用有其自身的特点，其终体积小，容易在1.5 ml离心管中进行。但是其不易挥发，且特别是在-70摄氏度放置沉淀时容易与蔗糖和氯化钾等共沉淀，因此，原则上使用无水乙醇沉淀。B. 如果要去除盐离子、有机溶剂等，可以用70%乙醇漂洗，但是70%乙醇漂洗后DNA沉淀与管壁结合较为松散，移去上清液时要小心。同时，加入的70%的乙醇要超过管子体积的三分之二。C. 小于200 bp的DNA使用乙醇沉淀非常的困难。因此，在加入乙醇前调整溶液中含有0.01 M 氯化镁，有利于小片段DNA的沉淀。D. 一般情况下，纯化后的DNA很容易复溶。但在溶液中含有氯化镁或者大于0.1 M 氯化钠的情况下，DNA难以溶解。可以通过使用少量的低盐离子浓度的溶液溶解后调整到一定的盐离子浓度。如果样品较难溶解于小体积的溶液中，则可以加入大体积的溶液然后重新用无水乙醇沉淀。E. 如果是纯化RNA，那么需要至少2.5倍体积的无水乙醇沉淀RNA。F. 去除DNA溶液中的三磷酸可以通过两次沉淀的方法实现。沉淀过程中加入终浓度为2 M 的醋酸铵 。浓缩DNA通过使用2-butanol（2丁醇）或者n-butyl alcohol（1-butanol，1丁醇）浓缩DNA溶液。因为在使用这两种有机溶剂时，水分可以部分的进入有机相，而DNA以及盐离子等无法进入有机相。因此，通过几次的重复，就可以浓缩DNA溶液。通过这样的方法可以将待沉淀的DNA样品的体积浓缩到可以用无水乙醇沉淀的体积。1、加入等体积的2-butanol到DNA溶液中，充分混匀。注意：加入太多体积的2-butanol会导致水分丧失，DNA浓缩沉淀出来。2、离心1分钟，1600 g，移去上层有机相。3、重复1、2步骤直到所需体积。4、用水饱和的乙醚抽提，去除溶液中的2-butanol5、使用真空抽提去除乙醚注意：因为2-butanol抽提不能去除盐离子，因此盐离子的浓度也是升高的。可以通过透析或者用乙醇沉淀去除盐离子。