PCR产物克隆的方法和优缺点

2025年03月15日 23:51
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网友(1):

我来回答一下吧:
1.T/A
cloning
这种克隆方式利用的是,一般PCR所用的DNA聚合酶具有在PCR产物3‘端添加一个碱基A的特性,也就是说,实际上常规PCR的产物并不是平末端的,而是有一个突出的A碱基,为了对PCR产物进行高效的克隆,人们开发出了一种专门用于PCR产物克隆的载体--T载体,T载体是一个线性化的载体,其末端是一个突出的T,正好与PCR产物上突出的A配对,所谓的T/A克隆就是将带有突出A尾巴的PCR产物与T载体连接,然后转化宿主菌的克隆,这种克隆效率非常高,很容易成功,应用也非常广泛,常用于下游克隆操作前的PCR产物测序鉴定和方便对PCR产物进行酶切处理。
2.Restriction
stick
end
cloning
翻译过来就是限制性粘末端克隆,就是在PCR扩增引物的设计过程中,在引物中添加特定的酶切位点,这样经过PCR扩增后,得到的片段两端就带有需要的限制性酶切位点,对PCR产物进行酶切后,就可以直接与目的载体进行连接,实现克隆。这种方式省略了T/A克隆,一步到位,但是由于酶切位点位于片段末端,常常导致酶切效率较低,需要较长时间,必须设计好保护碱基。
3.Blunt-end
cloning
所谓的平末端克隆,就是用Klenow片段将PCR产物末端突出的A碱基补平,然后与带有平末端的载体进行平末端克隆,平末端克隆效率很低,这种方式一般应用的很少,只是当PCR扩增所用的酶是高保真聚合酶如Pfu时,因为这种酶不会再PCR产物末端添加额外的碱基,PCR产物为平末端的,这时可能会用到平末端克隆,其实对这种PCR产物进行一个加尾处理,再进行T/A克隆,可能更加简单一些,呵呵。

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