小片段DNA的PCR扩增程序

138KB还是138bp？你这个先弄清楚。
扩不出来主要是你引物的问题吧。和扩增程序没多大关系。

你变性30s、退火20s，延伸45s就行。

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你这两个引物Tm差异比较大。不过我想在55~57℃退火，用我上面给你的程序应该是能够成功的。一般的real-time PCR的扩增产物也就150bp左右。如果低于55℃还是P不出来，那估计就是你的引物有问题或者模板降解了。

你的引物设计得不是很好，2个Tm值不协调。
但是已经这样了，我建议你优化退火温度：
先设计53、55、57、59（或60）4组，之后如果有迹象，在那个出来条带的温度附近再细化一下，再次优化温度，比如，如果你在55度出来带了，再设计54、55、56试试看，也许就会很好了。

好运！

这个没有什么特别的吧，定量PCR一般扩增的长度也和你差不多。所以不存在小片段难扩增的问题。

要注意的东西和普通的PCR没有区别，主要是由于片段这么短，可能跑出来的电泳条带会容易和引物二聚体的位置比较接近，要注意和引物二聚体区分开来。

把体系检测一次，首先除了引物，和模板之外的其他反应溶液检测一遍，如果没问题，想想模板有没有问题？再没问题就看看你的引物设计有没有问题了。

PCR扩增：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法

恩。。上面说的对，跑高浓度胶

这个问题的归类挺好玩的。。。

你的Tm差好像太高了。。。我总是会避免有这么大的差值的。万不得已会用touch-down PCR